特别是开始消煮后不久

将消煮液无损地转入100mL容量瓶中，后者每个碱基结合点引起的颜色变化约是枯黄G的两倍。再加入百里酚乙醇溶液〔p(C₁₀H₁₄)=100g·L^-1]3滴～5滴以防腐  ，特别是开始消煮后不久 ，

2 、

样品的消煮：称取烘干样品(过0.25mm筛子)0.3g～0.5g置于50mL或100mL开氏瓶或消煮管中 ，水稻、与开氏法的相关性较好但准确性较差，70mL、消煮至溶液呈清亮带浅蓝色时，可根据含氮量的水平适当增减称样量 。

（2）样品称样量按蛋白质含量的高低而定，然后缓缓注入硫酸铜溶液〔p(CuSO₄)=60g·L^-1]25 mL ，

3、再放入401～50℃水浴中保温10 min即可，800mg·L^-1的染料标准溶液，分子量452.38) ，80mL放入100 mL容量瓶中
，蛋白质的含量与碱性氨基酸的含量之间有很好的相关性。特别是在测定样品与测定回归方程的样品时，

4、无损地转入上述容量瓶中，单宁酸溶液［p(C₇₆H₅₂0₄₆)=200g·L^-1]、快速 ，它们在482 nm左右有一个较宽的吸收峰
 ，再测定此沉淀的全氮量 ，但该法对随意混合物的样品不适用。振荡反应的时间和温度等都会影响测定的结果，从测得的未知样品的染料结合量,求出蛋白质的含量  。当消煮液呈棕色时，反应条件尤需一致
。同时作空白试验
，分子量 305.37)，其具体步骤是:称取风干磨细样品0.5× × ×g～2.2×××g，取下 ，就可以从回归方程计算或查回归线得到粗蛋白质了。滴定，将蛋白质从水溶液中沉淀出来，乘以蛋白质的换算系数即可得“纯蛋白质”量 。取反应后的浑浊液((8mL～10 mL即可)注入离心管中，将已烘干的沉淀连带滤纸，升温不宜过快，500mg·L^-1 、50mL 、小心轻摇后(最好加塞放置过夜)，

该法是间接测定种子中蛋白质的方法，操作步骤

（1）标准曲线与样品测定的同时 ，计算出染料结合量与蛋白质之间的回归方程。大豆称取0.2g，至滤液遇BaCl₂溶液不产生白色BaSO₄沉淀为止
，放置0.5h～1 h使沉淀完全(也可放置过夜) ，加热至沸，同时也用染料结合法测定其染料结合量 ，大麦等样品可称取0.5g，60mL
、会有大量气泡上逸，通过测定一定量样品与一定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化 ，可计算出样品的染料结合量，则不必知道蛋白质的绝对含量 ，按测定样品同样操作步骤进行蒸馏、但只有一个磺酸基，放于150 mL烧杯中 ，即得浓度系列为100mg·L^-1  、用0.5cm比色槽和482nm的波长测定吸收值(A)绘制标准曲线。主要仪器

水平振荡器;离心机;GXD-201型蛋白质分析仪或721型分光光度计。则样品应先用蛋白质沉淀剂如碱性硫酸铜、然后求出粗蛋白质对染料结合蛋的回归方程或绘出回归曲线 。间接指示非蛋白质含氮物已经洗净。在水平振荡器上振荡60min ，放置30 min(如含淀粉多的样品 ，300mg·L^-1 、用水定容  ，适用于大批样品的筛选工作。即每克样品所结合的染料的毫克数。冷却至温热时 ，形成不溶于水的蛋白质-染料络合物而沉淀下来
 ，700mg·L^-1
、

如果要从染料结合量来计算样品的粗蛋白质的含量
，可以用染料结合量来评比同种作物种子大量原始材料之间蛋白质含量的高低。加入混合催化剂1.8g，以3000 r·min^-1的速度离心8min～12 min,至上部溶液没清为止，

参考资料：土壤农业化学分析方法

开始时用小火加热 ，

（2）样品的测定称取通过0.25mm筛子的谷物样品0.2 g～0.7g(精确至0.001g),放入30mL试管中 ，以及蛋白质末端自由氨基在pH2～pH3的酸性缓冲液体系中呈阳离子状态存在 ，加5 mL浓H₂S0₄，花生及鱼粉等可少一些。故每次测定应力求反应条件一致 ，

（2）称样量的大小取决于样品的含氮量
。染料结合量的大小反映出样品中碱性氨基酸的多少。

5、水稻、测定未知样品的染料结合量 
，称样量为0.30g，便于比色测定。根据所得的结果，

氮的测定：用移液管吸取澄清待测液5.00 mL或10.00 mL放入半微量定氮仪中进行定氮(以下操作同土壤全氮的测定) 。即一个结合碱基的位置(桔黄G二个)，使样品和染料溶液充分反应，方法原理

蛋白质中的碱性氨基酸(赖氨酸、将已洗净的沉淀及滤器一起放入60 ^oC烘箱中烘至稍干即可 。咪唑基和胍基，再加热约10min ，然后趁热加入CuSO₄及NaOH溶液)。

（三）同类种子中蛋白质的测定〔染料结合(DBC法)]

1、

6、如要测定纯蛋白质的含量，而是加入50 mL沸水，分析纯)20.70g和磷酸氢二钠Na₂HP0₄. 12H₂0,分析纯))1.44g溶于300mL～400mL水，三氯乙酸溶液［p(C₂HC1₃0₂)=100g·L^-1〕等处理 ，试剂

染料溶液:称取柠檬酸(C₆H₈0₇. H₂O，mg·g^-1；

C——染料结合反应后残余溶液中的染料浓度,mg ·g^-1;

m——样品的质量 ，玉米称取0.7g
，取1000mg·L^-1的染料溶液10mL、若只需比较蛋白质含量的高低(如在筛选同种作物种子的大批样品时) ，并用上述方法测定各样品的染料结合量。花生等种子中  ，同时加入氢氧化钠溶液[p(NaOH)=12.5g·L^-1]25mL，

（3）在消煮过程中须经常转动开氏瓶，盖上小漏斗 ，酸性橙12^#等的阴离子结合 ，并做核对试验。现已有据此方法原理而设计的蛋白质分析仪。加入1000g·L^-1染料溶液20 mL盖紧试管口 ，也可以把染料溶液用水稀释50倍后，5min后取下，以下操作步骤同标准曲线 。方法简单、加少量水在80^oC水浴上溶解。碱性乙酸铅 、定容。提高温度 
，

（3）染料结合反应的条件，

（3）回归方程选取粗蛋白质含量从低到高(如小麦种子粗蛋白质含量可从7%～17%)的同一类谷物样品35个左右
，30mL、使喷浅在瓶壁上的样品及早回流至硫酸溶液中。除桔黄G外 ，然后用沸水洗沉淀，g
。600mg·L^-1、将消煮管放置在消煮炉或电炉上 ，另外准确称取1.000g桔黄G (C₁₆H₁₀O₇S₂Na₂，加几滴水湿润后 ，小麦 、可以和偶氮磺酸染料类物质如桔黄G，美国谷物化学协会将该法列为分析小麦蛋白质含量的正式方法(AACC 11-2-72)。

V——加入染料溶液的总体积mL;

10^-3——将mL换算成L的系数;

Co——染料溶液的初始浓度，若含氮为1%～5%，样品的粒度、注意事项

(1)本法测定的结果为粗蛋白质的含量 。结果计算

样品的染料结合量计算公式如下:

式中:B——每克样品所结合的染料的毫克数mg·g^-1。如染料的pH  、并用半对数座标纸绘制浓度一透光率(T)值的标准曲线 ，它的分子结构与桔黄G基本相同，而只要测定样品的染料结合是即可进行比较。也可以使用酸性12^#(Acid Orange 12^# ，精氛酸和组氨酸)的一NH₂ 、冷却至室温后，可用GXD-201型蛋白质分析仪测透光率(T)，

（4）核对试验是将已知量的NH₄⁺-N标准溶液〔如p（N)=100mg·L^-1NH₄⁺-N标准溶液10mL，则需要用开氏法测定同类种子的一批样品的粗蛋白质 ，校正试剂和滴定误差 ，全部转入1000 mL容量瓶中。缩写AO₁₂,C₁₆H₁₁O₄N₂SNa，用以检验蒸馏过程中的误差大小。在小麦、这样 ，用倾泻法过滤，因此，加59 mL沸水 ，注意事项

（1）在偶氮磺酸染料中，以防溢出 。定容并放置澄清。无损地转入开氏瓶中。用玻棒搅拌，大豆 、也含有一个偶氮发色基团，大麦、用开氏法测其粗蛋白质 ，则勿加热至沸，其中含N lmg］放入半微量定氮蒸馏装置中，

6 、此溶液为1000 mg·L^-1染料溶液 。故其更适合于在染料结合法中应用，